Texto Traduzido do Artigo Original:
Impacto da estimulação ovariana induzida por FSH na recuperação de oócitos e na produção in vitro de embriões em vacas da raça Sindi Vermelha
Ivo Pivato¹, George Henrique Lima Martins¹, Lucas Costa de Faria², Heidi Christina Bessler³, Carlos Frederico Martins²,³
¹Departamento de Zootecnia, Universidade de Brasília, Distrito Federal, 70910-900, Brasil
²Departamento de Saúde Animal, Universidade de Brasília, Distrito Federal, 70910-900, Brasil
³Centro de Tecnologia para Raças Zebuínas Leiteiras da Embrapa Cerrados, Planaltina,
Distrito Federal, Brasil
RESUMO
O FSH desempenha um papel importante na regulação dos eventos reprodutivos, particularmente no desenvolvimento folicular e na aquisição da competência oocitária. Alguns estudos utilizando protocolos com FSH em bovinos zebuínos já foram realizados, porém os dados referentes à sua aplicação na raça Sindi Vermelha são escassos, justificando novos estudos. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o regime de administração de FSH — doses múltiplas (T1-m) e dose única (T2-s) — e o período de coasting (54 h vs. 102 h) sobre a competência de desenvolvimento dos oócitos em fêmeas Sindi.
Um total de 80 mg de FSH foi administrado em dose única (40 mg IM + 40 mg SC) e comparado a aplicações múltiplas (30 mg + 30 mg + 20 mg, IM). Animais que não receberam tratamento com FSH serviram como controle (CT). Os dados demonstraram que tanto as aplicações T1 quanto T2 resultaram em maior número de folículos médios (7,80 vs. 8,57; P < 0,05) e maior recuperação de oócitos (9,76 vs. 9,81) quando comparadas ao controle (5,20 e 6,30, respectivamente).
Os animais do tratamento T2 também apresentaram maior número de folículos aspirados (12,52 vs. 8,70; P < 0,05), oócitos viáveis (7,33 vs. 4,45; P < 0,05) e taxa de blastocistos (43,22% vs. 29,11%; P < 0,05) em comparação aos animais controle.
Os resultados demonstraram que uma dose reduzida de FSH, tanto em aplicação única quanto múltipla, melhora a competência de desenvolvimento oocitário. Além disso, uma única aplicação de FSH associada a um período de coasting mais longo oferece vantagens práticas, tornando essa abordagem mais atrativa para programas de melhoramento da raça Sindi.
Palavras-chave: Reprodução Assistida; Coasting; Fertilização In Vitro; Zebu
A raça Sindi Vermelha é um bovino zebuíno (Bos indicus) originário do Paquistão, caracterizado pela pelagem vermelha, porte médio, tolerância ao calor, rusticidade e potencial de dupla aptidão para produção de carne e leite (Barros et al., 2020; Mello et al., 2016). No Brasil, as condições climáticas favoráveis e a disponibilidade de pastagens de alta qualidade e água permitem a plena expressão do potencial produtivo da raça, tornando o gado Sindi economicamente vantajoso nos sistemas nacionais de produção (Panetto et al., 2017). Além disso, a raça é reconhecida por sua alta fertilidade e precocidade sexual, características importantes para o melhoramento genético e a redução do intervalo de gerações (Mello et al., 2020). Isso reforça a importância de estudar e aprimorar a eficiência das técnicas reprodutivas nessa raça.
A produção in vitro de embriões (PIVE) tem sido um foco central da biotecnologia reprodutiva por muitos anos, não apenas por sua capacidade de aumentar a eficiência reprodutiva de machos e fêmeas, mas também por acelerar a disseminação de animais geneticamente superiores (Ferre et al., 2020). Diversas estratégias têm sido investigadas para melhorar a competência de desenvolvimento dos oócitos. Um princípio bem estabelecido na literatura é a associação positiva entre o tamanho folicular e a capacidade de produzir um oócito competente, capaz de ovular com sucesso e sustentar o desenvolvimento embrionário subsequente (Lonergan et al., 1994).
Consequentemente, vários estudos avaliaram a superestimulação ovariana (OvS) por meio de múltiplas administrações de FSH antes da aspiração folicular (ovum pick-up, OPU) como estratégia para aumentar a produção de blastocistos e, por fim, as taxas de prenhez (Vieira et al., 2014).
O hormônio folículo-estimulante (FSH) exerce papel central na fisiologia reprodutiva, contribuindo para a espermatogênese em touros e para o crescimento folicular e aquisição da competência de desenvolvimento oocitário em vacas (Roelen, 2019). Considerando isso, inúmeros estudos avaliaram protocolos de estimulação ovariana associados à PIVE como estratégia para aumentar a eficiência reprodutiva de doadoras de oócitos (Blondin et al., 2002; Egashira et al., 2019; Hayden et al., 2023; Nivet et al., 2012; Ongaratto et al., 2020; Pinheiro et al., 2023).
Lonergan et al. (1994) sugeriram que os efeitos benéficos do FSH sobre a produção de embriões estão amplamente relacionados ao aumento do diâmetro folicular, o qual está associado a melhores taxas de recuperação de oócitos. Por outro lado, diversos estudos demonstraram um efeito positivo direto do FSH sobre a qualidade do oócito, resultando em maiores taxas de blastocistos (Egashira et al., 2019; Hayden et al., 2023; Nivet et al., 2012; Ongaratto et al., 2020).
Sugere-se que a simples estimulação por aplicações subsequentes de FSH pode não ser suficiente para melhorar a competência oocitária. Blondin et al. (2002) propuseram que um período de privação de FSH, denominado coasting, é essencial para induzir alterações celulares necessárias no oócito, aumentando seu potencial de desenvolvimento embrionário.
Nesse contexto, diversos estudos buscaram determinar o intervalo ideal entre a última aplicação de FSH e a OPU. Nivet et al. (2012), por exemplo, testaram quatro períodos de coasting (20, 44, 68 e 92 horas) e concluíram que os intervalos mais eficazes situaram-se entre 44 e 68 horas. Um estudo interessante em ovelhas demonstrou que um coasting de 60 horas melhorou a qualidade oocitária e a expressão de genes relacionados à qualidade (Pinheiro et al., 2023).
Ainda são escassas as pesquisas sobre protocolos ideais de estimulação hormonal e duração do coasting em bovinos da raça Sindi Vermelha. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de administrações únicas ou múltiplas de FSH e dois intervalos de coasting (54 ou 102 horas) sobre a qualidade dos oócitos e a produção in vitro de embriões nessa raça.
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação brasileira vigente e previamente aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade de Brasília (UnB/DOC nº 136522/2013).
O estudo foi conduzido no Centro de Tecnologia para Raças Zebuínas Leiteiras (CTZL) da Embrapa Cerrados, localizado em Brasília, Distrito Federal, Brasil (15°57′09″ S e 48°08′12″ W). A região integra o bioma Cerrado, o segundo maior do país, com cerca
de 204 milhões de hectares, representando 24% do território nacional. A precipitação média anual varia de 800 a 1800 mm. As estações climáticas são bem definidas, com invernos secos e verões chuvosos. O clima é tropical, com temperaturas médias entre 22
°C e 23 °C (Sano et al., 2019).
Foram utilizadas doze vacas Sindi não lactantes e não gestantes, todas com bom escore corporal (3,70 em escala de 1 a 5), peso médio de 400 kg e idade média de 6 anos. Os animais foram mantidos em sistema de pastejo rotacionado com Panicum maximum Jacq. cv. Mombaça, com água e suplementação mineral ad libitum durante todo o experimento.
No início do período experimental, todos os animais foram examinados quanto à presença de folículo dominante (FD). Folículos maiores que 5 mm foram aspirados para remoção do folículo dominante (RFD). Imediatamente após a RFD, todas as fêmeas foram sincronizadas no dia 0 (D0) com um dispositivo intravaginal de progesterona (1 g; Cronipres®, Biogénesis-Bagó S.A., Buenos Aires, Argentina), que permaneceu até a OPU no dia 7 (D7).
Três tratamentos experimentais foram avaliados:
Após cada OPU, todos os animais receberam um novo implante intravaginal, iniciando- se uma nova repetição. Foram realizadas cinco repetições para cada tratamento, com intervalo de 7 dias entre as OPUs (Figura 1).
As avaliações foram divididas em duas etapas:
Etapa 1 – Avaliação Folicular: contagem e mensuração de todos os folículos visíveis por ultrassonografia (transdutor linear de 7,5 MHz), classificados como pequenos (<3 mm), médios (3–8 mm) ou grandes (>8 mm).
Etapa 2 – Avaliação da PIVE: avaliação da produção in vitro de embriões após OPU, incluindo número de folículos aspirados, oócitos recuperados, oócitos viáveis, taxa de clivagem e taxa de blastocistos no D7.
Figura 1. Representação esquemática do delineamento experimental.
Houve maior número de folículos médios (P < 0,05) em ambos os tratamentos com OvS em comparação ao controle. Não foram observadas diferenças quanto aos folículos pequenos e grandes (Tabela 1).
Tabela 1. Número de folículos por categoria de diâmetro (média ± EP) por vaca Sindi estimulada com aplicação múltipla (T1-m) ou única (T2-s) de FSH.
Tamanho de folículo
Tratamentos
| <3mm | 3-8mm | >8mm | |
| T1 (m) | 0.52±0.17 | 7.80±0.80ª | 1.20±0.23 |
| T2 (s) | 0.76±0.24 | 8.57±1.04ª | 1.38±0.24 |
| Controle | 0.80±0.33 | 5.20±0.51b | 1.50±0.19 |
a,bLetras diferentes na mesma coluna indicam diferenças entre os grupos (P < 0,05). Controle: sem estimulação com FSH.
Não houve diferença no número médio de COCs recuperados entre T1-m e T2-s, porém ambos apresentaram valores superiores ao controle (P < 0,05). O número de oócitos
viáveis foi semelhante entre os tratamentos hormonais, mas apenas o tratamento com dose única diferiu do controle (P < 0,05) (Tabela 2).
Tabela 2: Número de folículos aspirados, oócitos recuperados e oócitos viáveis por vaca Sindi (Média ± EPM) estimulada com aplicação múltipla (T1 m) ou única (T2 s) de FSH
| Tratamentos | Folículos
aspirados (n) |
Oócitos Recuperados
(n) |
Oócitos
Viáveis (n) |
| T1 (m) | 11.36±1.39ab | 9.76±1.32ª | 6.72±1.04ab |
| T2 (s) | 12.52±1.81ª | 9.81±1.83ª | 7.33±1.32ª |
| Controle | 8.70±0.74b | 6.30±0.82b | 4.45±0.51b |
a,bLetras diferentes na mesma coluna indicam diferenças entre os grupos (P < 0,05). Controle: sem estimulação com FSH.
A taxa de clivagem foi menor no tratamento com dose única em comparação às doses múltiplas (84,75% vs. 93,52%). Entretanto, o tratamento T2-s apresentou maior taxa de blastocistos no D7 em comparação ao controle (43,22% vs. 29,11%; P < 0,05), resultando em aproximadamente 45% mais embriões por OPU (Figura 2).
No nosso experimento, o uso de uma concentração reduzida de FSH em doses únicas e múltiplas induziu um aumento no número de folículos e no seu tamanho, na viabilidade dos oócitos e, consequentemente, nas taxas de produção embrionária, reforçando a sua importância como ferramenta reprodutiva. Uma única aplicação de FSH em fêmeas Red Sindhi, associada a 102 h de coasting, produziu cerca de 45% mais embriões por OPU em comparação com o tratamento controle.
É bem conhecido que o FSH desempenha um papel importante na biologia reprodutiva dos mamíferos, induzindo o crescimento folicular nas fêmeas e participando ativamente da aquisição do desenvolvimento dos oócitos (Roelen, 2019). Quando o seu uso é prolongado, como em protocolos de OvS, espera-se que mais folículos passem por essas etapas, resultando em mais de um folículo atingindo o estágio dominante. Os nossos resultados mostraram que o uso de FSH em aplicações únicas e múltiplas aumentou o número de folículos médios (3 a 8 mm; P<0,05), destacando a importância da suplementação com FSH no desenvolvimento folicular. Outros estudos que utilizaram estimulação ovariana observaram um padrão semelhante de crescimento folicular. Quando Blondin et al. (2002) testaram dois protocolos diferentes de OvS com 4 ou 6 aplicações de FSH e distintos intervalos de coasting (33 e 48 h) antes da OPU, observaram que novilhas Holandesas tratadas com FSH, independentemente do intervalo de coasting, apresentaram mais folículos (>3 mm) do que o grupo não tratado. Além disso, Hayden et al. (2023) também observaram que o uso de FSH em doses múltiplas resultou em um maior número de folículos médios (6–10 mm) em novilhas Holandesas gestantes, em comparação com folículos grandes ou pequenos.
Nas fêmeas tratadas com FSH, o aumento no número de folículos esteve diretamente associado a um maior número de oócitos recuperados, indicando uma correlação positiva entre o desenvolvimento folicular e o rendimento de oócitos (9,76 e 9,81 vs. 6,3 COCs/OPU/vaca, respectivamente para T1 (m), T2 (s) e CT). Está descrito na literatura que a punção de folículos maiores que 4 mm resulta em menor taxa de recuperação de COCs (Seneda et al., 2001); entretanto, a relação entre o tamanho folicular e a sua capacidade de recuperação é controversa. Ao comparar o efeito de uma única aplicação de FSH em bovinos japoneses, Egashira et al. (2019) descreveram que, embora tenha ocorrido um aumento no tamanho dos folículos, não houve diferença na recuperação de oócitos, sugerindo que o tamanho folicular não teve efeito. O mesmo foi observado em novilhas Holandesas gestantes por Hayden e colaboradores (2023). Os nossos resultados contrastam com esses achados, e uma possível explicação baseia-se no aumento do número de folículos proporcionalmente ao aumento do seu tamanho nos ovários de vacas Red Sindhi estimuladas, o que pode ter resultado em um maior número de estruturas recuperadas.
O uso de FSH em aplicações únicas e múltiplas teve um impacto positivo na viabilidade dos oócitos, melhorando a qualidade morfológica dos oócitos no nosso estudo. Esse achado contrasta com os resultados relatados por Hayden et al. (2023), que observaram que múltiplas aplicações de FSH em novilhas gestantes não impactaram a viabilidade dos oócitos. Juntamente com as diferenças na qualidade morfológica, os resultados apresentados mostraram que o uso de FSH promoveu uma melhora na competência oocitária, aumentando a taxa de produção embrionária em aproximadamente 15%. Apesar da menor taxa de clivagem observada no tratamento com dose única de FSH em comparação aos grupos com doses múltiplas e controle, esse protocolo resultou em um maior rendimento de blastocistos no Dia 7. Muitos autores relataram que o uso da superestimulação realmente melhora o desenvolvimento de blastocistos (Egashira et al., 2019; Hayden et al., 2023; Nivet et al., 2012; Vieira et al., 2014; Vieira et al., 2016), reforçando a sua importância como ferramenta reprodutiva na eficiência da produção de embriões.
Os nossos resultados também demonstraram que uma única aplicação de FSH é eficiente em induzir aumento no número de folículos, na viabilidade dos oócitos e nas
taxas de produção embrionária, assim como o uso de múltiplas aplicações de FSH, podendo, contudo, ser uma estratégia melhor devido à redução no manejo dos animais. Em contraste, embora uma única administração de FSH tenha influenciado a resposta ovariana, Chaubal et al. (2007) relataram que múltiplas aplicações de FSH melhoraram a eficiência ovariana em vacas Angus mestiças antes da OPU e resultaram em taxas de blastocistos mais elevadas em comparação tanto à administração única quanto aos grupos controle. Bovinos Bos indicus são conhecidos por serem mais sensíveis à administração de gonadotrofinas exógenas (Baruselli et al., 2006) do que raças Bos taurus. Estudos de OvS na raça Sindhi ainda são escassos. Alguns autores relatam que uma dose menor (100 mg), em aplicações múltiplas, teve efeito bem-sucedido na indução de múltiplas ovulações em doadoras Sindhi primíparas e nulíparas (Mattos et al., 2011). Um estudo realizado por Carvalho et al. (2010) avaliou o uso de diferentes concentrações (100, 133 e 200 mg) de FSH na resposta à superestimulação em Sindhi. Apesar da melhor resposta indicada pelo maior número de corpos lúteos (CL) com a dose de 200 mg, houve uma menor taxa de recuperação de estruturas por lavagem uterina em comparação aos outros grupos de dose. Uma possível explicação é que doses mais elevadas de FSH podem aumentar o número de oócitos que permanecem retidos nos folículos, os quais luteinizam em vez de ovular (Clark et al., 2022).
No presente estudo, todas as doadoras Sindhi foram submetidas à estimulação hormonal semanal, o que pode aumentar o risco de distúrbios endócrinos e metabólicos. Para minimizar esses riscos, foi utilizada uma dose mais baixa de FSH (80 mg). Além disso, optou-se pelo uso de FSH de hipófise suína diluído em solução salina, uma vez que a sua meia-vida na corrente sanguínea é curta. De acordo com Demoustier et al. (1988), o pFSH apresenta uma meia-vida de eliminação relativamente curta, de aproximadamente 5 horas no plasma circulante, enquanto a depuração total é estimada em cerca de 10 a 12 horas.
No tratamento 2, o uso de uma dose única de pFSH com uma primeira aplicação intramuscular e uma segunda aplicação subcutânea teve como objetivo prolongar levemente a ação do FSH sobre os folículos ovarianos, bem como reduzir o manejo dos animais na fazenda, evitando a aplicação de múltiplas doses ao longo de vários dias. Como as repetições foram semanais, também não foi utilizado nenhum veículo carreador que prolongasse a liberação de FSH por um período mais longo, como o hialuronano, um glicosaminoglicano natural biocompatível que tem sido utilizado como diluente para sustentar a liberação prolongada de diversos fármacos (Oh et al., 2010).
Apesar da redução da dosagem e do número de aplicações, todas as doadoras apresentaram uma resposta ovariana satisfatória. Nesse contexto, o nosso estudo é o primeiro a demonstrar a eficácia de doses mais baixas de FSH e de um menor número de aplicações na estimulação de uma resposta favorável em vacas Sindhi.
De acordo com os resultados, tanto a aplicação única quanto múltipla de FSH aumentam significativamente a competência de desenvolvimento dos oócitos, resultando em maior produção de blastocistos. Além disso, uma única aplicação de FSH
associada a um período de coasting mais longo simplifica o manejo dos animais e reduz o estresse, tornando essa abordagem mais prática e de fácil implementação.
Ivo Pivato: conceituação, metodologia, supervisão e revisão final do manuscrito; George Henrique Lima Martins: metodologia, investigação e curadoria de dados; Lucas Costa de Faria: redação, revisão, edição e visualização; Heidi Christina Bessler: metodologia, investigação e curadoria de dados; Carlos Frederico Martins: conceituação, metodologia, supervisão, redação do manuscrito original, revisão final, administração do projeto e captação de recursos.
Os autores agradecem à Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF) pelo apoio financeiro.
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
